日本女优大全 东说念主类神经干细胞溶酶体互异遗传导致的不合称Notch活性

插插插网

你的位置:插插插网 > 男同 按摩 > 日本女优大全 东说念主类神经干细胞溶酶体互异遗传导致的不合称Notch活性
日本女优大全 东说念主类神经干细胞溶酶体互异遗传导致的不合称Notch活性
发布日期:2024-10-07 20:23    点击次数:80

日本女优大全 东说念主类神经干细胞溶酶体互异遗传导致的不合称Notch活性

  

摘抄

对称和非对称细胞分裂分别是干细胞扩增和产生更可靠后代的保守战略。在这里,咱们说明在东说念主类神经干细胞(NSC)中,溶酶体在有丝分裂经过中是不合称遗传的。咱们发现溶酶体含有Notch受体,Notch激活发生在酸性溶酶体环境中。溶酶体不合称性与Notch靶基因抒发关连赫斯1以及子细胞Notch信号的活性。此外,在东说念主脑发育的类器官模子中,溶酶体和Notch受体的不合称性也被不雅察到,有丝分裂图透露,溶酶体和Notch受体在仍附着于尖端膜的子细胞中优先遗传。因此,这项沟通标明,溶酶体行为信号要害的功能,在东说念主类神经干细胞不合称细胞分裂后,在子细胞之间设置了Notch信号活性的偏差。

简介

干细胞的界说既有自我更新的才调,也有产生疏化为更特定繁衍物的细胞的才调。不合称细胞分裂在有丝分裂经过中产生两个不同的伯仲姐妹是产生更多的细胞和细胞各类性的机制。在履历不合称分裂的细胞中,细胞气运决定因素被两个子细胞不合称地遗传,这照旧过被称为内在不合称。欺诈不同的模式生物和细胞谱系,已经细则了多种这么的决定因素,包括mRNAs、卵白质、卵白质复合物、集合体和细胞器,如内质网的构成部分、线粒体和囊泡结构【见(1–三)].后者包括内体的一个子集和最近在造血谱系中所证实的溶酶体(三)更具体地说,在黑腹果蝇与斑马鱼脊髓一样,以Smad受体激活锚定卵白(Sara)为标识的内体亚群分别被pIIa和p细胞优先遗传,何况Sara内体含有Notch受体和配体(4,5)最近的一项沟通标明,斑马鱼前脑也有雷同的机制,Notch配体在内化为内体后不合称散播(6)在东说念主类造血谱系中,溶酶体、自噬体和有丝分裂体在某些子细胞中不合称分离,这与给与细胞的不同代谢和氧化状况沟通(三)有东说念主以为Notch信号也可能在这个系统中施展作用,但莫得得到证实。在这里,咱们试图通过分离拓荒多颖慧细胞(iPSCs)产生的东说念主类神经干细胞(NSCs)来进展内溶酶体系统的亚细胞囊泡身分是否是不合称遗传的。咱们说明溶酶体在分裂的神经干细胞的子集聚不合称地分离。咱们进一步说明配体团结的Notch受体通过内吞路线参加溶酶体,何况受体细胞透走漏依赖于溶酶体遗传的Notch信号活性的互异。最后,咱们说明在东说念主脑发育的类器官模子中,不合称分裂的尖端桡神经胶质细胞也存在溶酶体和Notch的不合称性。

截止东说念主iPSCs繁衍神经干细胞沟通细胞不合称性

行为沟通亚细胞身分对称或不合称遗传的实验模子,咱们使用了从东说念主类iPSCs中取得的剖判可扩展的NSC群体[图S1A和(7)].在助长因子-成纤维细胞助长因子2(FGF2)和上皮助长因子(EGF)的存鄙人,这些细胞可在不变嫌其助长能源学或分化潜能的情况下扩增(7,8)这些神经干细胞的一个特征是在体外形成玫瑰花状结构。图1A透露了本沟通中欺诈的两个孤独健康个体产生的两个细胞系的典型助长模式。细胞产生的花环透走漏尖端-基底极性,中心腔由雅致长入象征物闭锁带-1和极性因子卵白激酶Cλ象征(图S1B)。在助长因子的存鄙人,大多数细胞对NSC关连转录因子Sox2和中间丝巢卵白呈阳性,惟一少数细胞抒发神经标识物,如东说念主类神经元卵白HuC/D或βIII微管卵白(Tubb3)(图1A)培养物的剖判增殖说明在这种条款下细胞分裂的模式基本上是对称的。相通在这些彭胀条款下出现的神经元的低百分比数目进一步标明了一小部分细胞的自觉分化。接下来,咱们通过沟通Sox2和HuC/D在1周内的时刻进度来沟通FGF2退出后的分化能源学。在分析的7天内,细胞总额基本保合手剖判(图S1C)。3天后,咱们不雅察到HuC/D略有增多+细胞(占细胞总额的14.0±1.2%)。分化5天后,HuC/D的百分比+分化后7天使经元数目增多到18.1±1.6%,达到26.2±2.0%(图1C)根据这些分化能源学推断,咱们遴荐FGF2退出后的第3天行为时刻点,在进一步的实验中沟通亚细胞囊泡身分的对称和/或不合称遗传,因为这个时刻点在培养物的细胞身分发生显耀变化之前。

图1东说念主类神经干细胞在FGF2退出后趋于分化,伴跟着有丝分裂经过中LAMP1不合称分离的增多。

(A)从两个健康对照细胞系(Ctrl#1和Ctrl#2)取得的具有代表性的亮场图像和玫瑰花结型神经干细胞的免疫染色,以检测NSC象征物(Sox2和Nestin)和神经元象征物(Tubb3和HuC/D)。(B和C)Sox2和HuC/D的免疫染色和NSCs数目的各自定量(Sox2+)神经元(HuC/D+)FGF2从Ctrl#1-NSCs退出后7天(n=3,Bonferroni多重比较执行的双向方差分析,均值+SEM)。(D和E)LAMP1对称和非对称分离的代表图像+和CD63+Ctrl#1-NSCs有丝分裂经过中的小泡。黄线表示子细胞周围的ROI,由DAPI和phalloidin染色细则(也可参见图S1E)。(F和G)基于配对联细胞之间的和强度比(见图S1D)在有或莫得FGF2的情况下对LAMP1和CD63不合称性进行量化(N=6张来自三个孤独实验的封面纸n=每份盖玻片42至58个细胞,Bonferroni多重比较执行的双向方差分析,平均值+扫描电镜)。(H)在Ctrl#1-NSCs不同有丝分裂期LAMP1与Notch1受体共配的代表性图像。(I)不合称指数的关连性A在Ctrl#1和Ctrl#2-NSCs中的灯1和槽口1。点代表单个有丝分裂事件,线性回来透露。比例尺,100μm(A和B)、10μm(D、E和H)、5μm[放大(H)]。DNA用DAPI复染*P<0.05和***P<0.001。n、 不进攻。另请参见图S1。

溶酶体的不合称遗传与神经干细胞分化经过中Notch受体的不合称散播沟通

然后咱们寻找象征内溶酶体室不同组分的抗原散播,并量化其对称或不合称遗传。为此,咱们设置了一个不合称指数(A)根据有丝分裂末期成对联细胞的免疫荧光染色强度和计较(图S1D)。根据DNA和肌动卵白染色分别细则有丝分裂期和子细胞面积(图S1E),何况以为有丝分裂事件与A>0.2。与伯仲细胞比拟,其中一个子细胞的总和强度超越50%。咱们发现,在一小部分分裂中,早期内切体象征物早期内切体抗原1(EEA1)和Rab5是不合称分离的,而晚期内切体(Rab7)则是不合称分离的+)回收内体(Rab11+)萨拉亚群+内体和自噬体(LC3+)极不均匀散播(图S1F)。在分析的大量有丝分裂事件中,由溶酶体关连膜卵白1(LAMP1)和LAMP2象征的溶酶体以及以CD63象征的多囊体被不合称地分离到两个子细胞中(图1,D和E,以及图S1F)。这一截止在分析子细胞间分离的囊泡数目时得到了证实(图S1G)。为了将这一不雅察截止与决定子细胞的气运沟通起来,咱们径直比较了增殖培养物(+FGF2)和分化培养物中LAMP1和CD63的不合称性(?FGF2)。咱们发现非对称性LAMP1从26.53±2.84%和30.21±2.62%显耀增多到Ctrl#1和Ctrl#2分别为38.05±3.92%和40.21±2.83%,而CD63的不合称散播百分比在FGF2退出后莫得变嫌(图1,F和G)这些截止标明LAMP1有定向分离+促分化条款下神经干细胞有丝分裂经过中的小泡。在两个孤独的神经干细胞系之间,不合称分裂细胞的比例似乎高度保守,这标明一个共同的潜在机制促进了从增殖性细胞分裂到神经源性细胞分裂的更始。

接下来咱们对LAMP1中的细胞气运决定因素感有趣+囊泡不错鉴识出来。Notch信号身分的不合称分离被姿首为几种生物体神经干细胞不合称细胞分裂和细胞气运决定因素的介导者(4,6,9,10)因此咱们沟通了Notch1绝顶亚细胞散播。使用不同抗体的Notch1染色导致具有泡状图案的Notch1散播,这与Notch1在其配体团结时通过内溶酶体运载进行处理的念念法一致[图S1H和(11–13)].然后咱们寻找Notch1和LAMP1的共定位,发目下有丝分裂周期的几个染色囊泡结构中有重复(在中期、后期和末期进行了沟通;图1H).A Notch1与CD63同期出现+囊泡也不错检测到,但较着更小(图S2,A和B)。Notch1受体在子细胞间的总体散播与LAMP1相似,何况透露Notch1受体与LAMP1在每个子细胞对中的散播呈正关连。在Ctrl#1和Ctrl#2平分析的细胞分裂率分别为41.89%和31.58%,Notch1和LAMP1是由LAMP1不合称地共同承袭的高的子细胞(图1I)相悖的子代细胞中莫得发现具有不合称遗传的有丝分裂事件。这种关连性让咱们假定LAMP1的不合称性可能会影响细胞气运的决定,至少在一定程度上,是通过使Notch信号行为偏向其中一个子细胞。

配体团结的Notch1受体通过网格卵白介导的内吞作用被内吞并运载到溶酶体

对Notch1和LAMP1在NSCs中的定位进行免疫细胞化学分析,教唆LAMP1中存在受体+溶酶体。为了进一步考证这一发现,亚细胞组分用蔗糖梯度离心分离(14)当沟通Notch1和LAMP1在梯度的不同部分中的存在时,两种抗原都以高度相似的模式被检测到,标明这两种抗原都存在于疏通的亚细胞室中(图2,A至C)与此相悖,其他囊泡象征物在组分中透走漏不同的轮廓。CD63+粒子与萨拉+内质体亚群仍透露与Notch1受体部分重复,但在低蔗糖组分中富集更为激烈,其中内质体象征物EEA1显耀蕴蓄。这标明,在咱们的细胞系统中,Notch1受体不存在于(早期)内体中,而是向溶酶体运载。值得堤防的是,早老素1行为γ-分泌酶复合体的主要身分,其散播模式雷同于Notch1和LAMP1,这可能标明卵白酶复合体对Notch1的S3裂解发生在溶酶体中。

图2在网格卵白介导的内吞作用后,Notch1受体在溶酶体中蕴蓄。

(A)从Ctrl#1-NSCs中网络蔗糖梯度组分的代表性Western blot。(B和C)囊泡标识物(B)、Notch1受体和γ-分泌酶亚基prenilin1(C)沿蔗糖梯度的卵白质定量[n=3,平均值+SEM,行为参考,再次在(C)中对LAMP1的平均值。(D和E)用0.1%(v/v)二甲基亚砜(D)或50μM dynasore(E)处理1小时后,对Ctrl#2-NSCs的LAMP1和Notch1进行免疫染色。(F)dynasore调治前后LAMP1和Notch1受体的Manders共现分析(N=来自三个孤独实验的179个细胞,Kruskal-Wallis训练和Dunn的多重比较执行,单个细胞的点盒图)。(G)CTB-AF555染色和N1ECD和网格卵白免疫染色的Ctrl#2-NSCs的代表性图像。比例尺,20μm(D、E和G)和5μm[放大(D)、(E)和(G)]。用DAPI复染(D和E)***P<0.001。

为了沟通受体从细胞名义转运到溶酶体的机制,咱们用dynamin扼制剂dynasore处理细胞,发现两种抗原的共定位性裁减,Notch1-LAMP1共存的Manders系数显耀裁减(图2,D至F)Notch1胞外结构域(N1ECD)与网格卵白共定位,而与脂筏关连的霍乱毒素B亚单元(CTB)不共定位,标明Notch1受体的内化是由网格卵白介导的(图2G)这些实验共同说明了Notch1受体通过网格卵白和动态卵白介导的内吞作用和Notch1受体向LAMP1的转运+咱们神经干细胞系统中的溶酶体。为了解释Notch1向酸性溶酶体的内化和转运是否是在配体团结的基础上启动的,咱们使用重组pHrodo象征的东说念主类delta-like protein 1(DLL1)Notch配体并进行了内化分析。在溶酶体的酸性环境中,pHrodo染料是荧光性的,加入象征配体后30min,第一个pHrodo信号变得较着,跟着时刻的推移迟缓增多,何况不错被dynasore透顶阻断,再次标明这是一个动态卵白驱动的经过(图3A以及图S2C)。pHrodo信号与LysoTracker染料的荧光信号共定位,指令溶酶体中的共定位(图3A)基于共焦活体细胞成像的Kymographs不仅透露了DLL1 pHrodo的里面化,还透露了pHrodo的细胞内能源学+LysoTracker公司+小泡。(图3B)一些佛罗多+结构保留或变成LysoTracker?,这可能是由于LysoTracker只对高度酸化的溶酶体亚群染色,仅代表由LAMP1象征的系数囊泡的一个子组分(图S2D)。为了阐述配体与受体团结后的靶向内化,咱们在DLL1调治30分钟后进行免疫染色。咱们大概用Notch1染色法检测到DLL1的雀斑共定位,这标明DLL1不是马上内化的,而是行为一种配体-受体复合物(图3C)在DLL1处理60分钟时,识别出内在的DLL1缺口复合物在有丝分裂事件中与伯仲姐妹分离(图S2E)。进一步的笔据标明这些复合物被转移到溶酶体中,DLL1的共染色透露了这少许+缺口1+点状带灯1(图3C).

图3Notch内化是由配体团结触发的,而囊泡酸化是受体激活所必需的。

(A)从LysoTracker染色的Ctrl#2-NSCs的活体细胞成像的代表性帧运转,在时刻点0添加DLL1 pHrodo。LysoTracker-和pHrodo单阳性囊泡结构分别用红色箭头和绿色箭头表示,双阳性结构用黄色箭头表示。(B)Ctrl-NSCOTR2与MOCDLACH2共聚焦成像。LysoTracker-和pHrodo单阳性囊泡结构分别用红色箭头和绿色箭头表示,双阳性结构用黄色箭头表示。(C)三个卵白质的Ctrl-6S孵育30分钟后,用Ctrl-6NSCA象征3个卵白质。(D到F)用0.1%(v/v)二甲基亚砜、20μM DAPT、100 nM BafA或200μM亮氨酸处理2小时后,对裂解的N1ICD、总Notch1和肌动卵白进行Western blot和Ctrl#1-NSCs的定量分析(n=4,用Bonferroni多重比较执行进行单因素方差分析,平均值±SEM)。(G)Notch卑劣靶基因抒发的折叠变化赫斯1,赫斯5,和嗨1用0.1%(v/v)二甲基亚砜、20μM DAPT、100nm BafA或200μM亮氨酸处理Ctrl#2-NSC 2小时(n=3,用Bonferroni多重比较执行进行单因素方差分析,平均值±SEM)。比例尺,20μm(A和C)、5μm[放大(C)]和10μm(B)。时刻刻度,hh:minmin:ss(A)*P<0.05。另请参见图S2。

由于Notch1-DLL1复合物被转运到溶酶体中,γ-分泌酶亚基prenilin1和LAMP1在蔗糖梯度上的散播相似,咱们盘考Notch信号的激活是否依赖于内溶酶体内的酸化环境。为了处罚这个问题,咱们用空泡型H调治神经干细胞+腺苷三磷酸酶扼制剂bafilomycina1(BafA)着重内溶酶体酸化(图S2F)。对Notch1的γ-分泌酶裂解产品Notch1胞内结构域(N1ICD)进行免疫痕迹分析,发现N1ICD的数目显耀减少,未捣毁的Notch1受体有幽微蕴蓄(图3,D至F)用γ-分泌酶扼制剂DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酸]-s-苯甘氨酸丁酯)处理细胞透走漏相配相似的成果,解救了Notch的激活裂解依赖于膀胱内pH值下跌的不雅点,leupeptin(Leu)对溶酶体卵白酶的扼制既莫得变嫌Notch1受体水平,也莫得变嫌N1ICD的数目(图3,D至F).DAPT处理2小时也会导致LAMP1内Notch受体的蕴蓄+小泡(图S2G),标明着重γ-分泌酶裂解增多了LAMP1中未捣毁的缺口1+小泡。信号通路的激活通过靶基因的转录激活进一步分析,赫斯1,赫斯5,和嗨1与卵白质水平上的截止一致,经DAPT或BafA处理的NSCs,Notch靶基因的抒发较着裁减,且与DAPT或BafA处理的NSCs相似(图3G)这些数据标明,在咱们的NSC系统中,Notch受体的内化依赖于配体团结,而受体的活化卵白水解裂解依赖于内溶酶体中的酸化环境。

不合称LysoTracker分离与HES1抒发增多沟通

咱们目下的数据透露+囊泡通过分裂神经干细胞而非对称地遗传,也将Notch1与γ-分泌酶身分不合称地分离,从而通过开释Notch-ICD激活Notch信号。为了沟通溶酶体不合称散播后产生的子细胞是否透露Notch活性的互异日本女优大全,咱们通过在Notch靶基因的内源性位点中引入td番茄荧光团的修饰序列来构建Notch信号叙述细胞系赫斯1使用CRISPR-Cas9介导的基因裁剪(图4A).赫斯1通过T2A序列与富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)(NLS-PEST)-TD番茄审定位序列络续,以确保HES1卵白功能不受插手。生成的HES1(Hes家眷bHLH转录因子1)叙述系抒发多潜能象征Oct3/4、Sox2和阶段特异性胚胎抗原4(SSEA4)(图S3A)。通过Sanger测序(图S3B)考证了构建体的无疤痕整合。靶向iPSCs产生的NSCs在形态和象征抒发上与野生型NSCs相似(图4B)如预期,iPSCs不透露Notch信号活性,因此莫得td番茄抒发,而其繁衍的NSCs则透露高水平的HES1驱动的td番茄抒发(图4C以及图S3C)。用Notch信号扼制剂DAPT处理神经干细胞后,通过培养物的形态学变化不错看到免强的神经元分化,伴跟着HES1叙述信号的下调(图S3D)。通过环己酰亚胺扼制卵白质合成被用于测量HES1叙述者的半衰期,该半衰期约为3.2小时(图S3E)。HES1叙述系的忠良度足以监测DAPT处理对Notch信号的扼制或BafA对囊泡酸化的扼制(图4,D和E)与此相悖,在沟通N1ICD卵白水闲居,扼制溶酶体卵白酶活性并莫得变嫌HES1叙述信号(图4,D和E).

图4.HES1叙述者追踪神经干细胞的Notch信号行为。

(A)CRISPR-Cas9介导的使用Ctrl#2-iPSCs生成HES1叙述细胞系的靶向战略(特质参见图S3)。(B)对HES1叙述神经干细胞的神经干细胞(Nestin和Sox2)和神经元标识物(Tubb3和HuC/HuD)进行免疫染色。(C)CRISPR-Cas9裁剪花环型神经干细胞的典型亮场图像,TD番茄抒发标明激活的Notch信号。(D和E)用0.1%(v/v)二甲基亚砜、20μM DAPT、100 nM BafA或200μM Leu处理的HES1叙述神经干细胞进行12小时的活性细胞成像和强度和量化(N=来自三个孤独实验的27个细胞,Bonferroni多重比较执行的双向方差分析,平均值±SEM)。还透露了DAPT和BafA处理的指数回来弧线以及DMSO和Leu的线性回来弧线。比例尺,100μm(B和C)和50μm(D)。在(B)顶用DAPI复染细胞核。时刻刻度hh:minmin:ss*P<0.05。另请参见图S3。

经典三级电影

然后咱们使用HES1叙述细胞系来监测子细胞中Notch活性,这是由于细胞分裂时酸性囊泡的对称和不合称分离酿成的。为此,咱们监测了LysoTracker染色的HES1叙述神经干细胞的单个有丝分裂事件,并在末期定量分析了LysoTracker信号(图5A)根据亮场图像和td番茄信号对分裂细胞和各自的子细胞进行识别。此外,溶酶体散播的不合称性被界说为雷同于用指数进行免疫染色的LAMP1不合称性A>0.2。共松弛了124个对称和31个不合称有丝分裂事件,并进一步分析了HES1叙述者在配对联细胞中的抒发(图5B)在有丝分裂后,由于有丝分裂经过中TD番茄卵白的遗传疏通,两个伯仲姐妹透走漏相似的荧光强度。从有丝分裂事件后15分钟运转的时刻推移记载标明,在接下来的几个小时内,叙述者的不合称性被设置(在所形容的例子中,由于经受较少溶酶体的子细胞的强度裁减;电影S1)。因此,由于叙述者的半衰期约为3小时(图S3E),在LysoTracker量化90分钟后运转量化td番茄荧光能源学,并在细胞分裂时刻点后追踪子细胞6小时(图5C)子细胞间HES1抒发的互异标明,由于LysoTracker不合称的细胞分裂,HES1抒发有较着的偏向性(图5D以及图S3F)。由于数据里面互异很大,这一趋势并不显耀。因此,为了更夺目地了解HES1的抒发动态,将TD番茄模式按其欧氏距离分为四类[图5、E和F,和(15)]:(i)对称HES1抒发式;(ii)HES1的不合称抒发,与最后期的LysoTracker散播相悖;在给与细胞分裂时,hesotracker(iii)和(iii)对细胞分裂有幽微的不合称性。当比较透露对称LysoTracker散播的HES1叙述者不合称性与那些透露不合称LysoTracker散播的分区的不合称性时,咱们不雅察到对称和幽微不合称的HES1驱动的叙述者行为的百分比只发生细小的变化(分别为46.0%和41.9%和22.6%对22.6%)(图5G)咱们不雅察到,史塔克的非对称性增多了25.1%,与之形成激烈对比。同期,叙述者抒发不合称的分裂比例也出现了两半(19.7%对9.7%)。这些数据解救这么一个假定:配对联细胞中Notch信号活性的偏差部分是由溶酶体小泡的定向穿梭介导的。

图5溶酶体不合称性与神经干细胞开头的HES1互异抒发沟通。

(A)用LysoTracker染色的有丝分裂HES1叙述NSC的活细胞成像的代表性时刻帧。根据LysoTracker强度和的定量,子细胞1被界说为有丝分裂末期(时刻点0)经受到更多LysoTracker信号的细胞。(B)LysoTracker对称和不合称细胞分裂的散播(n=10个孤独实验)。(C)有丝分裂后1.5至6小时,子细胞1和2中TD番茄信号的代表性时刻帧。(D)互异z-LysoTracker对称和不合称分裂子细胞1和2的归一化强度和(N=124/31,对于10个孤独实验的对称/不合称细胞分裂,平均值+扫描电镜)。(E)HES1在子细胞对中抒发能源学的热图和聚类分为四组:(i)对称的,(ii)相悖的不合称的,(iii)幽微的和(iv)高度不合称的。(F)番茄不同群体荧光强度的动态变化(N=70、27、35和23,对于第1组到第4组,来自10个孤独实验,平均值为±SEM)。(G)HES1叙述神经干细胞分裂经过中LysoTracker对称和非对称遗传后HES1的抒发动态和集合频率(N=124/31的对称/不合称细胞分裂来自10个孤独实验)。20μm(A和C)。时刻刻度hh:minmin:ss(A和C)。另请参见图S3。

溶酶体和Notch1的不合称分离与前脑器质细胞分裂沟通

到目下为止,咱们的数据标明Notch活性在分化NSCs的子代时是不合称遗传的,部分原因是含有酸性溶酶体的Notch1的不合称遗传。这一不雅察截止产生的一个主要问题是,这种分裂产生的子细胞是否具有不同的细胞特质。因此,咱们运转沟通东说念主类大脑类器官的细胞分裂。东说念主们一致以为,在类器官系统中,不错通过分裂细胞相对于皮质环尖端腔的位置来分辩对称和不合称分裂(16,17)第20天前脑类器质由几个由Sox2构成的皮质环构成+沿着心室样结构的祖细胞(图6A).咱们用鬼臼卵白和4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色鉴释怀室内膜有丝分裂细胞,并将其界说为平面分裂、分层分裂或中间分裂(图6、B和C)咱们在三批分析的类器官中发现了55.9±2.8%的平面型、22.8±5.4%的中间型和21.3±6.0%的分层有丝分裂事件(图6D)平面细胞分裂中LAMP1和Notch1散播的定量透露大部分为对称分离,其平均不合称指数为0.004±0.014?分别为0.012±0.015(图6,C和E)中间细胞分裂已经透走漏更不合称的散播趋势,何况分层细胞分裂的不合称指数显耀增多,LAMP1和Notch1的不合称指数分别为0.130±0.036和0.098±0.031(图6E)这将LAMP1和Notch1的不合称性以及随后出现的Notch信号行为偏差与发育中的东说念主类皮层模子系统中神经源性细胞分裂沟通。附着在根尖膜上的神经干细胞给与更多的溶酶体,因此具有更高的Notch活性,保合手其干细胞特质,而从根尖膜分层的细胞则被激活的Notch信号所铺张,并可能在有丝分裂后进行神经元分化。

图6前脑器质细胞分裂透露LAMP1和Notch1在心尖子细胞中有偏定位。

(A)20天大的前脑类器质免疫染色的代表性图像,NSC象征物Sox2和神经元象征物Tubb3,皮质环用白色虚线表示。(B)前脑类器质的图示,皮质环和神经干细胞在环的尖端膜以平面、中间或分层的样貌分裂。(C)前脑类器官的免疫组化染色,包括鬼臼卵白、LAMP1和Notch1。在尖端膜(黄色虚线)分裂的细胞被指南针染色,并分为平面的,中间的,或分层的细胞分裂。透露ROI(黄色)区域内的LAMP1和Notch1信号。(D)(B)中界说的细胞分裂模式散播(n=3个孤独实验,平均值+扫描电镜)。(E)基于成对联细胞之间的和强度比(另请参见图S1)对LAMP1和Notch1不合称性进行量化(N=60/28/19来自三个孤独实验的平面/中间/分层细胞分裂,Kruskal-Wallis执行和Dunn的多重比较执行,单个有丝分裂事件的点盒图)。比例尺,300μm(A)和5μm(C)。在(A)顶用DAPI复染细胞核**P<0.01。

磋磨

内溶酶体路线的囊泡身分在有丝分裂经过中是不合称遗传的(三–5).在SOP中D、 黑腹菌斑马鱼神束缚的脊髓前体细胞(Sara象征的内分体的一个子集)被透露为向该本族传递Notch受体和Notch配体,后者赓续增殖,这标明Notch组分的这种偏差与保管干细胞/祖细胞特质沟通(4,5)然则,在这些模子生物体中,囊泡转运的机理基础已经绝顶明晰,何况依赖于细胞内极性和沿极化微管的转运(4–6,18,19)电位Notch激活的机制尚不明晰。最近,在哺乳动物的造血谱系中,溶酶体和降解机制的其他构成部分的不合称遗传被说明不错瞻望经受细胞的代谢状况和产生的细胞各类性(三)在这项沟通中,Notch通路的构成部分被说明是共阻塞的,尽管Notch活性的影响莫得进一步磋磨。

在咱们的沟通中,咱们说明溶酶体在东说念主神经干细胞中不合称分离,何况这些溶酶体含有配体团结的Notch受体。咱们发现,当重组配体团结后,配体-受体复合物通过内吞路线参加溶酶体,何况γ-分泌酶复合物的组分在疏通的亚细胞组分中以密度梯度分离。这与已发表的γ-分泌酶亚细胞定位沟通一致(20,21)咱们的沟通发现,溶酶体酸化的扼制在生物学上雷同于特异性γ-分泌酶扼制。这些数据标明Notch裂解与溶酶体室的酸性环境之间存在沟通,这标明了先前尚未细则的机制,即囊泡受体本族细胞在分裂后何如偏离Notch活性水平。因此,咱们更进一步,通过团结非对称溶酶体遗传的活细胞检测和咱们通过基因靶向生成的Notch叙述细胞系来测定经受细胞中的Notch活性。这些实验标明,NSCs分裂经过中溶酶体的不合称性与子细胞的Notch活性偏差沟通。

咱们的实验环境不允许恒久追踪伯仲姐妹绝顶后代,也不允许产生血缘关系。由此,咱们弗成料定溶酶体和Notch受体细胞保合手着更具增殖性的雷同干细胞的气运。然则,强调这一假定的是咱们在东说念主脑类器官中所作念的不雅察。东说念主们一致以为,细胞分裂的平面和与心尖膜的附着程度不错瞻望子细胞的细胞气运,也即是说,离喜悦室区域且与心尖膜宣战较少的细胞易于分化,而附着在根尖膜上的细胞仍然是干细胞(16,17,22,23)在咱们的实验中,这些贴膜细胞给与了更多的溶酶体和更多的Notch受体,这相宜上述假定。萨拉东说念主+在咱们的神经干细胞系统中,内体莫得表现出不合称遗传的趋势。这标明脊椎动物的造血系统与低等脊椎动物的细胞遗传有偏差。值得堤防的是,咱们莫得磋磨给与细胞的代谢状况,因为在造血系统中进行的沟通莫得触及Notch活性(三)预料两种干细胞在遗传上的相似性是很较着的。因此,沟通其他干细胞和祖细胞群体以绝顶他物种,以细则溶酶体是否和何时成为东说念主类干细胞和祖细胞中的中心信号核心,以及是否、何时和为什么这可能从内体转移到酸性更强的溶酶体。

材料和方法伦理声明

本沟通中使用的iPSCs来自健康捐赠者。捐赠者予以书面知情容许。系数东说念主类材料的实验都相宜赫尔辛基宣言。

一般细胞培养

系数细胞在5%和37°C下培养,加入1:100青霉素链霉素(Invitrogen,15140122),并通过团聚酶链反馈(PCR)依期检测支原体。除非另有说明,细胞培养板在使用前涂上1:100盖特瑞克斯(Invitrogen,A1413302)。在实验室中制备氮气补充剂如下:杜尔贝科矫正鹰氏培养基(DMEM)/F12(Invitrogen,11320074)、胰岛素(500μg/ml)(Sigma-Aldrich,91077C)、转铁卵白(10 mg/ml)(Sigma-Aldrich T3705)、亚硒酸钠(520 ng/ml)(Sigma-Aldrich,A8960)、腐胺(1.611 mg/ml)(Sigma-Aldrich 51799),黄体酮(630ng/ml)(西格玛·奥尔德里奇,P8783)。沟通不同单元类型绝顶看重的更多夺目信息,请参见以下部分。

IPSC文化

用仙台病毒对两名健康成东说念主供者(ctrl#1:男性,活检年岁:33;ctrl#2:女性,活检年岁:44)的皮肤成纤维细胞重编程。在E8培养基中,在无饲养条款下,在Geltrex涂层板上保管IPSC:DMEM/F12,Hepes(Invitrogen,11330057),亚硒酸钠(14ng/ml)(Sigma-Aldrich,A8960),我-抗坏血酸磷酸酯(64μg/ml)(Sigma-Aldrich,A8960)、胰岛素(20μg/ml)(Sigma-Aldrich,91077C)、转铁卵白(11μg/ml)(Sigma-Aldrich,T3705)、FGF2(100 ng/ml)(细胞指挥系统,GFH146)和滚动助长因子β(2 ng/ml)(细胞指挥系统,GFH39)。前言是每天变化。使用EDTA(Invitrogen,15575020)进行分离,并将5μM Y-27632(细胞指挥系统,SM02)添加到培养基中24小时。

神经干细胞的神经拓荒与培养

用Smad和Wnt双重扼制拓荒iPSCs的神经气运。因此,将交融的iPSC培养基改为含有200 nM LDN193189、500 nM A83和2μM XAV 939的神经拓荒培养基,在DMEM/F12(Invitrogen,11320074)、0.5%N2(好处,见上文)、1

Powered by 插插插网 @2013-2022 RSS地图 HTML地图

Copyright Powered by365站群 © 2013-2024